- 题目：CGM 第178期: 后生动物DNA复制终止阶段复制体的解离调控机制
- 时间：欧洲中部时间 2021年8月25日（星期三）8PM（美国中部时间 8月25日 1PM，北京时间 8月26日 2AM）
- 主讲人：夏乙燧(Yisui Xia)，09/2009 – 10⁄2016 Ph.D. research in College of Biological Sciences, China Agricultural University, Laboratory of Prof. Huiqiang Lou; 10⁄2016 – Present Postdoctoral researcher in MRC PPU, University of Dundee, Laboratory of Prof. Karim Labib.
中文摘要
对于所有生物来说，DNA复制都是最为关键的生物过程。每种生物的遗传性状的维持，都依赖于其染色体准确且完整地复制。然而，个体中染色体上的所有DNA分子都必须复制一次且在细胞分裂前只能复制一次。这决定了DNA复制是一种高度复杂且被严格调控的生物过程 (O’Donnell et al., 2013) 。在真核生物中，DNA复制是一个由众多蛋白组成的超复合物来进行完成，该复合物被称作复制体（replisome）或者复制机器（replication machinery）(Baretic et al., 2020) 。真核生物的复制体的核心是复制解旋酶（replicative helicase）CMG复合物（CDC45MCM2-7GINS），该解旋酶是由六亚基MCM2-7 ATP水解酶（ATPase），CDC45蛋白以及四亚基复合物GINS所组成的十一亚基超复合物。在复制行进过程中，CMG解旋酶以十分稳定的构象环绕于复制叉前导链，从3’-5’的方向解开双螺旋DNA，为复制聚合酶提供复制模板 (Yuan et al., 2020) 。CMG解旋酶复合物需要在复制行进的过程中稳定地结合复制叉结构，否则双螺旋DNA将无法解开从而导致DNA复制无法完成。但是，当DNA复制完成以后，理论上已经不需要复制体这个强大的分子机器，那么复制体的命运将会是如何？
本人近期工作揭示了后生动物模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中，复制体解离的分子机制。DNA复制完成后，复制体会通过一系列的调控而发生解离。复制体解离的关键步骤是稳定的核心CMG解旋酶复合物的解离。后生动物复制体解离过程可以人为地分为两个步骤：首先CMG解旋酶的MCM-7亚基会被E3泛素连接酶 cullin-RING ligase CUL-2LRR-1泛素化而生成长链泛素；然后长链泛素会招募解折叠酶CDC-48/P97，将MCM-7亚基解折叠从而导致CMG解旋酶的崩塌进而致使复制体解离(Sonneville et al., 2017, Dewar et al., 2017) 。本研究通过多个纯化蛋白（由50条多肽组成的21个蛋白或者蛋白复合物），在体外完整重建了线虫复制体解离过程。首先通过对CMG泛素化的重建，作者们发现MCM-7亚基的泛素化分为起始泛素连接于目标位点（泛素化的起始）以及泛素链的延伸两步进行，两步依赖于不同的泛素化调控因子的参与。两步泛素化的过程均依赖于CUL-2LRR-1的类泛素化修饰neddylation。此外，我们还发现复制体组份中的TIM-1TIPN-1（人细胞TIMELESS-TIPIN的线虫同源蛋白）通过招募E3 CUL-2LRR-1对泛素化起着显著的促进作用。 在重建完成CMG泛素化之后，我们又纯化了解折叠酶CDC-48及其伴侣因子UFD-1NPL-4以及UBXN-3，以完成复制体解离的重建。酿酒酵母中，Cdc48的解折叠活性依赖于其伴侣因子Ufd1-Npl4 (Deegan et al., 2020) 。令人意外地是，线虫CDC-48的解折叠活性不仅依赖UFD-1NPL-4，在此基础上需要UBXN-3的额外参与。此外，泛素链的长度需要至少超过五个泛素才能有效地被解折叠酶识别。因此，当缺少TIM-1TIPN-1从而导致CMG泛素化程度降低，也进而导致了其下游解离过程亦受到严重影响。综上所述，通过体外重建复制体的解离，我们发现CUL-2LRR-1由TIM-1TIPN-1招募于CMG复合物进而保证了MCM-7被高效泛素化，长泛素链招募解折叠酶，在UFD-1NPL-4以及UBXN-3的协助下，多泛素化的MCM-7被解折叠酶CDC-48高效解折叠，从而致使CMG的崩塌以及复制体的解离。
众多纯体外研究经常被贴上“由人为因素干扰所致”的标签。基于此，我们同时也在体内线虫胚胎中验证了体外实验所得结果，发现其结果完全一致。为该体外重建系统增加了决定性的生理学意义。 回顾整个研究，利用纯化蛋白重建复杂生物过程，由于纯化蛋白的数量导致工作量与难度巨大。但随着生化科技技术水平的提高，这种复杂生物过程的体外重建越来越可行。英国Crick研究所John Diffley实验室于2015年首次成功在体外利用纯化蛋白重建了酿酒酵母DNA复制过程 (Yeeles et al., 2015)，这项里程碑式的工作深刻改变了整个DNA复制领域，也势必将对其他生物领域产生积极影响。在以体内试验为指导的前提下，体外重建是了解生物过程分子机理的最为清楚且最为直接的方式。可以预见该技术在例如药物筛选癌症病理分析等生物技术延伸应用中也必定会有光明的前景。
参考文献
Baek, K., Krist, D.T., Prabu, J.R., Hill, S., Klugel, M., Neumaier, L.M., von Gronau, S., Kleiger, G., and Schulman, B.A. (2020). NEDD8 nucleates a multivalent cullin-RING-UBE2D ubiquitin ligation assembly. Nature 578, 461-466.
Baretic, D., Jenkyn-Bedford, M., Aria, V., Cannone, G., Skehel, M., and Yeeles, J.T.P. (2020). Cryo-EM Structure of the Fork Protection Complex Bound to CMG at a Replication Fork. Mol Cell 78, 926-940 e913.
Deegan, T.D., Mukherjee, P.P., Fujisawa, R., Polo Rivera, C., and Labib, K. (2020). CMG helicase disassembly is controlled by replication fork DNA, replisome components and a ubiquitin threshold. Elife 9.
Dewar, J.M., Low, E., Mann, M., Raschle, M., and Walter, J.C. (2017). CRL2Lrr1 promotes unloading of the vertebrate replisome from chromatin during replication termination. Genes Dev 31, 275-290.
O’Donnell, M., Langston, L., and Stillman, B. (2013). Principles and concepts of DNA replication in bacteria, archaea, and eukarya. Cold Spring Harb Perspect Biol 5.
Scott, D.C., Rhee, D.Y., Duda, D.M., Kelsall, I.R., Olszewski, J.L., Paulo, J.A., de Jong, A., Ovaa, H., Alpi, A.F., Harper, J.W., et al. (2016). Two Distinct Types of E3 Ligases Work in Unison to Regulate Substrate Ubiquitylation. Cell 166, 1198-1214 e1124.
Sonneville, R., Moreno, S.P., Knebel, A., Johnson, C., Hastie, C.J., Gartner, A., Gambus, A., and Labib, K. (2017). CUL-2LRR-1 and UBXN-3 drive replisome disassembly during DNA replication termination and mitosis. Nat Cell Biol 19, 468-479.
Xia, Y., Fujisawa, R., Deegan, T.D., Sonneville, R., and Labib, K. (2021). TIMELESS-TIPIN and UBXN-3 promote replisome disassembly during DNA replication termination in C. elegans. EMBO J. In press. 40:e108053.
Yeeles, J.T., Deegan, T.D., Janska, A., Early, A., and Diffley, J.F. (2015). Regulated eukaryotic DNA replication origin firing with purified proteins. Nature 519, 431-435.
Yuan, Z., Georgescu, R., Bai, L., Zhang, D., Li, H., and O’Donnell, M.E. (2020). DNA unwinding mechanism of a eukaryotic replicative CMG helicase. Nat Commun 11, 688.