- 题目：CGM 第 178 期: 后生动物 DNA 复制终止阶段复制体的解离调控机制
- 时间：欧洲中部时间 2021 年 8 月 25 日（星期三）8PM（美国中部时间 8 月 25 日 1PM，北京时间 8 月 26 日 2AM）
- 主讲人：夏乙燧 (Yisui Xia)，09/2009 – 10⁄2016 Ph.D. research in College of Biological Sciences, China Agricultural University, Laboratory of Prof. Huiqiang Lou; 10⁄2016 – Present Postdoctoral researcher in MRC PPU, University of Dundee, Laboratory of Prof. Karim Labib.
中文摘要
对于所有生物来说，DNA 复制都是最为关键的生物过程。每种生物的遗传性状的维持，都依赖于其染色体准确且完整地复制。然而，个体中染色体上的所有 DNA 分子都必须复制一次且在细胞分裂前只能复制一次。这决定了 DNA 复制是一种高度复杂且被严格调控的生物过程 (O’Donnell et al., 2013) 。在真核生物中，DNA 复制是一个由众多蛋白组成的超复合物来进行完成，该复合物被称作复制体（replisome）或者复制机器（replication machinery）(Baretic et al., 2020) 。真核生物的复制体的核心是复制解旋酶（replicative helicase）CMG 复合物（CDC45MCM2-7GINS），该解旋酶是由六亚基 MCM2-7 ATP 水解酶（ATPase），CDC45 蛋白以及四亚基复合物 GINS 所组成的十一亚基超复合物。在复制行进过程中，CMG 解旋酶以十分稳定的构象环绕于复制叉前导链，从 3’-5’的方向解开双螺旋 DNA，为复制聚合酶提供复制模板 (Yuan et al., 2020) 。CMG 解旋酶复合物需要在复制行进的过程中稳定地结合复制叉结构，否则双螺旋 DNA 将无法解开从而导致 DNA 复制无法完成。但是，当 DNA 复制完成以后，理论上已经不需要复制体这个强大的分子机器，那么复制体的命运将会是如何？
本人近期工作揭示了后生动物模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中，复制体解离的分子机制。DNA 复制完成后，复制体会通过一系列的调控而发生解离。复制体解离的关键步骤是稳定的核心 CMG 解旋酶复合物的解离。后生动物复制体解离过程可以人为地分为两个步骤：首先 CMG 解旋酶的 MCM-7 亚基会被 E3 泛素连接酶 cullin-RING ligase CUL-2LRR-1 泛素化而生成长链泛素；然后长链泛素会招募解折叠酶 CDC-48/P97，将 MCM-7 亚基解折叠从而导致 CMG 解旋酶的崩塌进而致使复制体解离 (Sonneville et al., 2017, Dewar et al., 2017) 。本研究通过多个纯化蛋白（由 50 条多肽组成的 21 个蛋白或者蛋白复合物），在体外完整重建了线虫复制体解离过程。首先通过对 CMG 泛素化的重建，作者们发现 MCM-7 亚基的泛素化分为起始泛素连接于目标位点（泛素化的起始）以及泛素链的延伸两步进行，两步依赖于不同的泛素化调控因子的参与。两步泛素化的过程均依赖于 CUL-2LRR-1 的类泛素化修饰 neddylation。此外，我们还发现复制体组份中的 TIM-1TIPN-1（人细胞 TIMELESS-TIPIN 的线虫同源蛋白）通过招募 E3 CUL-2LRR-1 对泛素化起着显著的促进作用。 在重建完成 CMG 泛素化之后，我们又纯化了解折叠酶 CDC-48 及其伴侣因子 UFD-1NPL-4 以及 UBXN-3，以完成复制体解离的重建。酿酒酵母中，Cdc48 的解折叠活性依赖于其伴侣因子 Ufd1-Npl4 (Deegan et al., 2020) 。令人意外地是，线虫 CDC-48 的解折叠活性不仅依赖 UFD-1NPL-4，在此基础上需要 UBXN-3 的额外参与。此外，泛素链的长度需要至少超过五个泛素才能有效地被解折叠酶识别。因此，当缺少 TIM-1TIPN-1 从而导致 CMG 泛素化程度降低，也进而导致了其下游解离过程亦受到严重影响。综上所述，通过体外重建复制体的解离，我们发现 CUL-2LRR-1 由 TIM-1TIPN-1 招募于 CMG 复合物进而保证了 MCM-7 被高效泛素化，长泛素链招募解折叠酶，在 UFD-1NPL-4 以及 UBXN-3 的协助下，多泛素化的 MCM-7 被解折叠酶 CDC-48 高效解折叠，从而致使 CMG 的崩塌以及复制体的解离。
众多纯体外研究经常被贴上 “由人为因素干扰所致” 的标签。基于此，我们同时也在体内线虫胚胎中验证了体外实验所得结果，发现其结果完全一致。为该体外重建系统增加了决定性的生理学意义。 回顾整个研究，利用纯化蛋白重建复杂生物过程，由于纯化蛋白的数量导致工作量与难度巨大。但随着生化科技技术水平的提高，这种复杂生物过程的体外重建越来越可行。英国 Crick 研究所 John Diffley 实验室于 2015 年首次成功在体外利用纯化蛋白重建了酿酒酵母 DNA 复制过程 (Yeeles et al., 2015)，这项里程碑式的工作深刻改变了整个 DNA 复制领域，也势必将对其他生物领域产生积极影响。在以体内试验为指导的前提下，体外重建是了解生物过程分子机理的最为清楚且最为直接的方式。可以预见该技术在例如药物筛选癌症病理分析等生物技术延伸应用中也必定会有光明的前景。
参考文献
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Deegan, T.D., Mukherjee, P.P., Fujisawa, R., Polo Rivera, C., and Labib, K. (2020). CMG helicase disassembly is controlled by replication fork DNA, replisome components and a ubiquitin threshold. Elife 9.
Dewar, J.M., Low, E., Mann, M., Raschle, M., and Walter, J.C. (2017). CRL2Lrr1 promotes unloading of the vertebrate replisome from chromatin during replication termination. Genes Dev 31, 275-290.
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Sonneville, R., Moreno, S.P., Knebel, A., Johnson, C., Hastie, C.J., Gartner, A., Gambus, A., and Labib, K. (2017). CUL-2LRR-1 and UBXN-3 drive replisome disassembly during DNA replication termination and mitosis. Nat Cell Biol 19, 468-479.
Xia, Y., Fujisawa, R., Deegan, T.D., Sonneville, R., and Labib, K. (2021). TIMELESS-TIPIN and UBXN-3 promote replisome disassembly during DNA replication termination in C. elegans. EMBO J. In press. 40:e108053.
Yeeles, J.T., Deegan, T.D., Janska, A., Early, A., and Diffley, J.F. (2015). Regulated eukaryotic DNA replication origin firing with purified proteins. Nature 519, 431-435.
Yuan, Z., Georgescu, R., Bai, L., Zhang, D., Li, H., and O’Donnell, M.E. (2020). DNA unwinding mechanism of a eukaryotic replicative CMG helicase. Nat Commun 11, 688.